Establishing the CRISPR/Cas13a genome editing system in Nicotiana benthamiana for RNA targeting applications
Date
2021-12
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Globally, grapevine (Vitis vinifera) is a widely cultivated fruit crop and makes a vital
contribution to the South African agricultural sector. Highly susceptible to a plethora of virus
species, grapevine faces severe constraints to overall crop productivity and durable antiviral
strategies are necessary to control the spread of viral diseases. The CRISPR/Cas (clustered
regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated) technology has emerged as a
valuable genetic engineering tool for plant breeding purposes. Recently, genome editing by the
CRISPR/Cas system has been expanded beyond DNA targeting. A novel class 2 Cas effector,
Cas13a, has been revealed as a programmable RNA- targeting nuclease. Using CRISPR/Cas13a,
this study therefore aimed to investigate the potential of this system to mediate targeted RNA
cleavage and viral RNA interference in Nicotiana benthamiana. The choice of this model plant
allowed for an immediate test of the functionality and efficacy of this system. For this, binary
Cas13a vectors targeting regions of an annotated mRNA transcript from the carotenoid pathway were
assembled and transgenic N. benthamiana lines were established. A CRISPR/Cas13a-based
down-regulation of gene expression was not observed in these lines. However, after improving the
cellular localisation of the Cas13a/crRNA constructs, a transgenic line expressing a
cytoplasmic-localised Cas13a/crRNA vector showed a significant two-fold reduction in target gene
expression, further correlated with a lowered concentration of total carotenoid content
from a preliminary measurement. To demonstrate virus inhibition, a modified tobacco mosaic virus
(TMV) system expressing a green fluorescent protein (TRBO-GFP), was used to visually and
molecularly measure CRISPR/Cas13a-mediated interference activity in N. benthamiana. A
LwaCas13a/crRNA vector targeting a conserved region of the reporter mRNA was assembled
and after performing a series of transient assays, phenotypic quantifications of GFP signal
intensity confirmed a significant attenuation (~50%) in virus accumulation. However, RT-qPCR
analyses showed that GFP mRNA abundance was not directly proportional to that of the observed
GFP signal intensity, suggesting a possible limitation in the method of molecular
quantification of the GFP mRNA transcript levels. Overall, the results provide insight
into the functionality of the CRISPR/Cas13a system for RNA targeting of both an
endogenous transcript and a viral genome in plants. Further optimisation of crRNA design
features and the method of CRISPR component delivery are highlighted for future
studies, especially for an application in grapevine.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Wingerd (Vitis vinifera) is wĆŖreldwyd 'n algemeen-verboude vrugtegewas en maak 'n belangrike bydrae tot die Suid-Afrikaanse landbousektor. Aangesien wingerd hoogs vatbaar is vir 'n groot aantal virusspesies, staar die bedryf ernstige beperkings in die gesig ten opsigte van produktiwiteit, en word duur virus-beheerstrategieĆ« benodig om die verspreiding van virussiektes te beheer. Die CRISPR/Cas (gegroepeerde eweredig-gespasieĆ«rde kort palindromiese herhalings/CRISPR-geassosieerde) tegnologie het as 'n genetiese manipulasie toepassing vir planttelingsdoeleindes na vore gekom. Onlangs is genoom-redigering deur middel van CRISPR/Cas verder as net DNS as teiken uitgebrei. Die nuwe klas-2 Cas effektor, Cas13a, het as ān programmeerbare RNS-teiken nuklease te voorskyn gekom. Die doel van hierdie studie was om die potensiaal van CRISPR/Cas13a op geteikende RNS kliewing en virus-RNS inhibisie in Nicotiana benthamiana, te ondersoek. Die keuse van hierdie modelplant het die vinnige toets van beide funksionaliteit en doeltreffendheid van hierdie stelsel moontlik gemaak. Hiervoor is binĆŖre Cas13a vektore ontwikkel wat areas van ān geannoteerde bRNS transkrip van die karotenoĆÆed-weg teiken, en transgeniese N. benthamiana lyne is daargestel. 'n CRISPR/Cas13a- gebaseerde afregulering van geenuitdrukking was nie in hierdie lyne waargeneem nie. Na die verbetering van die sellulĆŖre lokalisering van die Cas13a/crRNS konstrukte egter, is 'n transgeniese lyn, wat 'n sitoplasmies-gelokaliseerde Cas13a/crRNA vektor uitdruk, ontwikkel wat 'n beduidende tweevoudige vermindering in teiken geenuitdrukking getoon het, en wat ook goed gekorreleer het met 'n verlaagde konsentrasie van totale karotenoĆÆed-inhoud. Om virus-inhibisie te demonstreer, is 'n gemodifiseerde tabak mosaĆÆek virus (TMV) stelsel, wat 'n groen-fluoresserende proteĆÆen uitdruk (TRBO-GFP), gebruik om die CRISPR/Cas13a-gemedieĆ«rde inhibisie-aktiwiteit in N. benthamiana, beide visueel en molekulĆŖr, te meet. 'n Cas13a/crRNS vektor wat 'n gekonserveerde streek van die merker-geen mRNS teiken, was ontwikkel wat in ān reeks tydelike uitdrukkingseksperimente ān beduidende verswakking (~50%) in virus-akkumulasie bevestig het. Kwantitatiewe molekulĆŖre ontledings van GFP bRNS uitdrukking kon egter nie ān direkte korrelasie met die waargenome GFP sein-intensiteit aantoon nie, wat moontlik dui op 'n beperking van die molekulĆŖre kwantifiseringsmetode. Saamgevat, gee die resultate ān insig in die funksionaliteit van die CRISPR/Cas13a stelsel vir RNS teikening van beide 'n endogene transkrip asook 'n virusgenoom in plante. Verdere optimisering van crRNS ontwerp en die metode van CRISPR-komponent toediening word benodig vir toekomstige studies, veral vir toepassings in wingerd.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Wingerd (Vitis vinifera) is wĆŖreldwyd 'n algemeen-verboude vrugtegewas en maak 'n belangrike bydrae tot die Suid-Afrikaanse landbousektor. Aangesien wingerd hoogs vatbaar is vir 'n groot aantal virusspesies, staar die bedryf ernstige beperkings in die gesig ten opsigte van produktiwiteit, en word duur virus-beheerstrategieĆ« benodig om die verspreiding van virussiektes te beheer. Die CRISPR/Cas (gegroepeerde eweredig-gespasieĆ«rde kort palindromiese herhalings/CRISPR-geassosieerde) tegnologie het as 'n genetiese manipulasie toepassing vir planttelingsdoeleindes na vore gekom. Onlangs is genoom-redigering deur middel van CRISPR/Cas verder as net DNS as teiken uitgebrei. Die nuwe klas-2 Cas effektor, Cas13a, het as ān programmeerbare RNS-teiken nuklease te voorskyn gekom. Die doel van hierdie studie was om die potensiaal van CRISPR/Cas13a op geteikende RNS kliewing en virus-RNS inhibisie in Nicotiana benthamiana, te ondersoek. Die keuse van hierdie modelplant het die vinnige toets van beide funksionaliteit en doeltreffendheid van hierdie stelsel moontlik gemaak. Hiervoor is binĆŖre Cas13a vektore ontwikkel wat areas van ān geannoteerde bRNS transkrip van die karotenoĆÆed-weg teiken, en transgeniese N. benthamiana lyne is daargestel. 'n CRISPR/Cas13a- gebaseerde afregulering van geenuitdrukking was nie in hierdie lyne waargeneem nie. Na die verbetering van die sellulĆŖre lokalisering van die Cas13a/crRNS konstrukte egter, is 'n transgeniese lyn, wat 'n sitoplasmies-gelokaliseerde Cas13a/crRNA vektor uitdruk, ontwikkel wat 'n beduidende tweevoudige vermindering in teiken geenuitdrukking getoon het, en wat ook goed gekorreleer het met 'n verlaagde konsentrasie van totale karotenoĆÆed-inhoud. Om virus-inhibisie te demonstreer, is 'n gemodifiseerde tabak mosaĆÆek virus (TMV) stelsel, wat 'n groen-fluoresserende proteĆÆen uitdruk (TRBO-GFP), gebruik om die CRISPR/Cas13a-gemedieĆ«rde inhibisie-aktiwiteit in N. benthamiana, beide visueel en molekulĆŖr, te meet. 'n Cas13a/crRNS vektor wat 'n gekonserveerde streek van die merker-geen mRNS teiken, was ontwikkel wat in ān reeks tydelike uitdrukkingseksperimente ān beduidende verswakking (~50%) in virus-akkumulasie bevestig het. Kwantitatiewe molekulĆŖre ontledings van GFP bRNS uitdrukking kon egter nie ān direkte korrelasie met die waargenome GFP sein-intensiteit aantoon nie, wat moontlik dui op 'n beperking van die molekulĆŖre kwantifiseringsmetode. Saamgevat, gee die resultate ān insig in die funksionaliteit van die CRISPR/Cas13a stelsel vir RNS teikening van beide 'n endogene transkrip asook 'n virusgenoom in plante. Verdere optimisering van crRNS ontwerp en die metode van CRISPR-komponent toediening word benodig vir toekomstige studies, veral vir toepassings in wingerd.
Description
Thesis (MScAgric)--Stellenbosch University, 2021.
Keywords
Grapevine genome editing, RNA editing, Plants -- Virus resistance, Grapevines (Vitis vinifera) -- South Africa, Nicotiana benthamiana, UCTD