Isolation and characterization of bacteriophages infecting UTI-associated bacteria and evaluation of phage-derived proteins as potential therapeutic agents and diagnostic probes
Date
2023-12
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Stellenbosch : Stellenbosch University
Abstract
ENGLISH ABSTRACT: Healthcare faces two major problems today, the increased emergence of antimicrobial resistance
and the need for rapid diagnostic testing of pathogenic bacteria. The over and or improper
prescription of antibiotics has further exacerbated this, also leading to major disruption of the
gut microbiome in individuals overcoming diseases. Bacteriophages (phages) can provide the
solutions to these current challenges as they solely infect their specific host bacteria. Utilizing
whole phages or phage proteins in therapeutics and diagnostics has increased rapidly over the
years, offering unique strategies of addressing today’s problems. In this study bacteriophages that
specifically target uropathogens were isolated from wastewater treatment plants. Several of these
phages were characterized on a genomic and physiological basis. Focus was drawn to a new species of
Proteus mirabilis phage belonging to the Novosibovirus genus. The newly identified
Proteus_virus_309 was found to drive the emergence of phage insensitive mutants (PIMs). The wild
type, phage susceptible, P. mirabilis and phage insensitive mutants were sequenced using the Oxford
nanopore sequencing platform which assisted in identifying multiple small nucleotide polymorphisms
(SNPs) that may be responsible for the observed phage resistance. Whole genome sequencing of
several phages provided an ample source for identifying genes with therapeutic and diagnostic
potential tail associated genes from Proteus_virus_309 and Proteus_porphage_301 were selected for
protein production and further analysis. Concurrently, previously characterized receptor binding
proteins (RBPs) genes from Salmonella bacteriophage vB_SenM-S16 and Staphylococcus aureus phage φ11
were also selected and synthesized. All the selected phage genes were successfully cloned,
expressed and the proteins fused with a green fluorescent protein (GFP) were his-tag purified. It
was confirmed a putative tail spike protein, TSL309 (ORF57), from Proteus_virus_309 possess
depolymerase like activity, evaluated using spot tests, Transmission Electron Microscopy (TEM) and
sodium dodecyl sulfate (SDS)-gel analysis of crude capsule extracts. The depolymerase activity
observed in TSL309 hampers the biofilm formation and increases de-fouling of Proteus cells on
polyvinyl chloride tubing. One aspect of this study shows the potential use of phage derived
depolymerases as aiding therapeutics, prompting the requirement for further research into the
synergism of phage depolymerases with antibiotics and immune responses in overcoming bacterial
infections. The second aspect of the study screened Salmonella and Staphylococcus phage RBPs, Gp38
and Gp45, fused with GFP for their binding capacity toward various bacterial isolates. Bacteria-RBP
interactions were evaluated with confocal super-resolution fluorescent microscopy and the
fluorescently labelled RBPs. Phage based probes
GFP-gp38 and GFP-45 were found to bind to their respective bacterial species, with gp45 binding
to a range across Staphylococcus and Enterococcus species. This study highlights a pipeline of
identifying, producing, and screening potential phage probes with possible incorporation into a
rapid Point of Care (PoC) biosensor device with the aim of providing accurate detection of
pathogenic bacteria.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Gesondheidsorg het vandag twee groot probleme, die verhoogde voorkoms van antimikrobiese weerstand en die behoefte aan vinnige diagnostiese toetsing vir patogeniese bakterieë. Die oor- en/of onbehoorlike voorskrif van antibiotika het dit verder vererger, wat ook gelei het tot groot ontwrigting van die dermmikrobioom by individue wat aan siektes lei. Bakteriofage (fage) kan die oplossings vir hierdie huidige uitdagings verskaf aangesien hulle slegs hul spesifieke gasheerbakterieë beinvloed. Die gebruik van die heel faag of faagproteïene in terapeutika en diagnostiek het oor die jare vinnig toegeneem en bied unieke strategieë om vandag se probleme aan te spreek. In hierdie studie is bakteriofage uit afvalwaterbehandelingsaanlegte geïsoleer wat spesifiek uropatogene teiken. Verskeie van hierdie fage is op 'n genomiese en fisiologiese basis gekarakteriseer. Die fokus is gevestig op 'n nuwe spesie Proteus mirabilis-faag wat aan die Novosibovirus-genus behoort. Daar is gevind dat die nuut geïdentifiseerde Proteus_virus_309 die opkoms van fage-sensitiewe mutante (PIM's) dryf. Die wildetipe, fage vatbare, P. mirabilis en faag- onsensitiewe mutante is gevolg deur gebruik te maak van die Oxford Nanopore volgordebepaling platform wat gehelp het met die identifisering van veelvuldige klein nukleotied polimorfismes (SNPs) wat verantwoordelik kan wees vir die waargenome faag weerstand. Die totale genoomvolgordebepaling van verskeie fae het 'n ruim bron verskaf om gene met terapeutiese en diagnostiese potensiaal te identifiseer. Gene van Proteus_virus_309 en Proteus_prophage_301 is geïdentifiseer en in silico-analise het ooreenkomste met hidrolase en faag-geassosieerde depolimerases getoon. Tweedens is gene van bekende reseptorbindende proteïene (RBPs) wat aan Salmonella- en Staphylococcus-fae behoort, gesintetiseer. Hierdie faag gene is suksesvol gekloon, uitgedruk en die proteïene gesuiwer met groen fluoresserende proteïen (GFP) as 'n samesmeltingsvennoot. TSL309, Proteus_virus_309, het depolimerase-aktiwiteit teen sy gasheer- Proteus-stam getoon wat met behulp van koltoetse, transmissie-elektronmikroskopie (TEM) en SDS-gel analise van kapsule-afbraak produkte geëvalueer. Die depolimerase-aktiwiteit wat in TSL309 waargeneem is, belemmer die biofilmvorming en verhoog die ontkoppeling van Proteus- selle op polivinielchloriedbuise. Die RBP's, Gp38 en Gp45, is gekies vir hul bindingskapasiteit teenoor verskeie bakteriese isolate. Bakterie-RBP-interaksies is geëvalueer deur gebruik te maak van konfokale super-resolusie fluoresserende mikroskopie. Hierdie studie toon die gemak van die vervaardiging van faagverwante peilers vir die moontlike inkorporering in 'n vinnige punt-van-sorg (PoC) biosensor toestel met die doel om akkurate opsporing van patogeniese bakterieë te verskaf.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Gesondheidsorg het vandag twee groot probleme, die verhoogde voorkoms van antimikrobiese weerstand en die behoefte aan vinnige diagnostiese toetsing vir patogeniese bakterieë. Die oor- en/of onbehoorlike voorskrif van antibiotika het dit verder vererger, wat ook gelei het tot groot ontwrigting van die dermmikrobioom by individue wat aan siektes lei. Bakteriofage (fage) kan die oplossings vir hierdie huidige uitdagings verskaf aangesien hulle slegs hul spesifieke gasheerbakterieë beinvloed. Die gebruik van die heel faag of faagproteïene in terapeutika en diagnostiek het oor die jare vinnig toegeneem en bied unieke strategieë om vandag se probleme aan te spreek. In hierdie studie is bakteriofage uit afvalwaterbehandelingsaanlegte geïsoleer wat spesifiek uropatogene teiken. Verskeie van hierdie fage is op 'n genomiese en fisiologiese basis gekarakteriseer. Die fokus is gevestig op 'n nuwe spesie Proteus mirabilis-faag wat aan die Novosibovirus-genus behoort. Daar is gevind dat die nuut geïdentifiseerde Proteus_virus_309 die opkoms van fage-sensitiewe mutante (PIM's) dryf. Die wildetipe, fage vatbare, P. mirabilis en faag- onsensitiewe mutante is gevolg deur gebruik te maak van die Oxford Nanopore volgordebepaling platform wat gehelp het met die identifisering van veelvuldige klein nukleotied polimorfismes (SNPs) wat verantwoordelik kan wees vir die waargenome faag weerstand. Die totale genoomvolgordebepaling van verskeie fae het 'n ruim bron verskaf om gene met terapeutiese en diagnostiese potensiaal te identifiseer. Gene van Proteus_virus_309 en Proteus_prophage_301 is geïdentifiseer en in silico-analise het ooreenkomste met hidrolase en faag-geassosieerde depolimerases getoon. Tweedens is gene van bekende reseptorbindende proteïene (RBPs) wat aan Salmonella- en Staphylococcus-fae behoort, gesintetiseer. Hierdie faag gene is suksesvol gekloon, uitgedruk en die proteïene gesuiwer met groen fluoresserende proteïen (GFP) as 'n samesmeltingsvennoot. TSL309, Proteus_virus_309, het depolimerase-aktiwiteit teen sy gasheer- Proteus-stam getoon wat met behulp van koltoetse, transmissie-elektronmikroskopie (TEM) en SDS-gel analise van kapsule-afbraak produkte geëvalueer. Die depolimerase-aktiwiteit wat in TSL309 waargeneem is, belemmer die biofilmvorming en verhoog die ontkoppeling van Proteus- selle op polivinielchloriedbuise. Die RBP's, Gp38 en Gp45, is gekies vir hul bindingskapasiteit teenoor verskeie bakteriese isolate. Bakterie-RBP-interaksies is geëvalueer deur gebruik te maak van konfokale super-resolusie fluoresserende mikroskopie. Hierdie studie toon die gemak van die vervaardiging van faagverwante peilers vir die moontlike inkorporering in 'n vinnige punt-van-sorg (PoC) biosensor toestel met die doel om akkurate opsporing van patogeniese bakterieë te verskaf.
Description
Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2019.